beat365官方网站凝聚态物理與材料物理研究所、人工微結構和介觀物理國家重點實驗室、國家生物醫學成像科學中心、北大-清華生命科學聯合中心、定量生物學中心毛有東教授團隊利用自主研發的深度學習高精度四維重建技術，發展并應用時間分辨冷凍電鏡，闡明了原子水平人源蛋白酶體動力學調控和構象重編程機制。2022年4月27日，相關研究成果以“時間分辨冷凍電鏡解析人源蛋白酶體在USP14調控下的變構”（USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM）為題，在線發表于國際頂級學術期刊《自然》（Nature）。同期，研究人員、審稿人和Nature編輯團隊聯合，在研究簡報（Research Briefing）專欄在線發表了題為“人體蛋白質降解機制的控制揭示”（Control of human protein-degradation machinery revealed）的推介文章，其中審稿人評價“該工作是一項重大研究，終于在原子水平解決了USP14活化和其調控蛋白酶體功能的機制問題”；Nature編輯團隊指出“這一工作通過時間分辨冷凍電鏡，結合功能分析，……，呈現了蛋白質降解過程中USP14和蛋白酶體的構象連續體”。這是首次将人工智能四維重建技術應用于大幅提升時間分辨冷凍電鏡分析精度，針對重大疾病靶蛋白複合體，實現原子水平功能動力學觀測的國際領先原創成果，展示了一類新型的蛋白質複合動力學研究範式。

蛋白質降解調控是極其重要的基本生物化學過程，在細胞周期、信号轉導、免疫響應、基因調控、新陳代謝、神經退行、癌症腫瘤、病毒感染以及蛋白毒性響應等主要細胞分子過程中發揮着關鍵的調控作用。在真核細胞中，絕大部分胞内蛋白都是通過泛素蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway），經過泛素化标記被蛋白酶體全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover，Irwin Rose和Avram Hershko三位科學家因“對該泛素化通路介導蛋白質降解的曆史性發現”被授予諾貝爾化學獎。蛋白酶體全酶，又稱為26S proteasome，是由中間一個圓柱形20S核心顆粒和兩端覆蓋的一個或兩個19S調節顆粒組成。19S包含一個環形異源六聚體馬達——AAA-ATPase，通過多個協同ATP水解模式調控蛋白酶體降解泛素化底物。蛋白酶體功能紊亂與人體多種疾病相關，如癌症、神經退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶體是美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的多種治療癌症的上市小分子藥物的直接靶标。在正常細胞中，蛋白酶體的功能受到多個水平的嚴格調控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶體調控分子，被認為是一個潛力巨大的治療癌症和神經退行性疾病的重要靶标，其小分子抑制劑曾進入過美國一期臨床研究，但圍繞USP14功能機制的一系列懸而未決的關鍵問題極大地限制了其靶向藥物分子的開發和臨床應用。USP14通過結合26S而被激活，然後以毫秒的時間尺度剪切底物上的泛素鍊；但其如何被蛋白酶體激活并調控蛋白酶體功能，一直是全球研究機構和生物制藥領域期待解決的關鍵科學問題。

生命分子機器通過高度複雜的非平衡動力學過程和結構變化來實現其特殊功能，這一過程進而受到各種複雜分子間相互作用的精準調控。如何在原子水平直接觀察天然态超大分子機器的功能态動力學過程，給現有的原子結構動态分析技術提出了空前挑戰。

毛有東教授團隊長期緻力于發展基于冷凍電鏡的動力學重建方法，圍繞蛋白酶體、炎症小體等具有重大臨床應用前景的靶點系統的結構功能、動力學機制和靶向調控分子設計深入開展前沿交叉研究。2016年，在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上報道了人源蛋白酶體基态的3.6 Å冷凍電鏡結構及其他三個亞納米分辨構象，并首次發現一個亞穩态構象的核心顆粒物轉運通道處于開放狀态（PNAS 2016; 113: 12991-12996）；2017年，利用冷凍電鏡解析高分辨率蛋白酶體19S調控複合體在結合組裝伴侶p28的自由态的三維結構，闡釋了組裝伴侶蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶體組裝過程中構象選擇的組裝機理（Molecular Cell 2017; 67: 322-333）；2018年4月，在《自然·通訊》（Nature Communications）上報道了6個ATPγS結合狀态下的26S蛋白酶體動态結構，包括三個核心顆粒複合物開放态對應的亞穩簡并态近原子分辨（4~5 Å）結構（Nature Communications 2018, 9: 1360）；2018年11月，在《自然》（Nature）上首次報道了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間态構象的高分辨（2.8~3.6 Å）結構，在原子水平呈現了蛋白酶體和底物相互作用的動态過程，首次實現了對AAA-ATPase六聚馬達分子内ATP水解全周循環的完整過程的原子水平觀測（Nature 2019; 565:49-55）。這一系列工作揭示了蛋白酶體的原子架構、組裝原理和降解泛素化底物的動力學基本規律。

圖1 (A) USP14調控下蛋白酶體複合體降解多泛素化底物的原子結構模型之一；(B) 時間分辨率冷凍電鏡解析13種中間态的統計分布随蛋白質降解進程的時間演化（Youdong Mao, CC BY 4.0）

科學研究的過程總是艱難曲折。要克服的首要困難是“時間分辨”：蛋白酶體降解底物的過程很快，時間尺度在毫秒至秒之間，正常條件下，想要通過冷凍電鏡技術捕獲此過程的中間态結構非常困難，因此，首先要讓這個過程慢下來。研究團隊通過大量的條件摸索，重建反應動力學體系和優化反應條件，包括優化緩沖體系、反應溫度等條件，優化出較為可行的實驗方案，從而使得時間分辨冷凍電鏡技術應用成為可能，最終獲得了含時的45,193張USP14-26S複合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個USP14-26S-泛素底物複合體的顆粒圖像。

接下來，面臨的極端挑戰是“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的複合體圖像需要經過一系列的分類，将它們歸為不同的構象類别，才能呈現出蛋白反應的動态過程。USP14結合到26S蛋白酶體後，使得降解底物的動力學過程更加複雜，想要在如此多的異構複合體顆粒圖像中，鑒别出降解過程的各個時态的高分辨率非平衡構象，傳統的三維分類方法是無法實現的。低精度的三維分類将導緻低分辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動力學信息，無法對含時的數據賦予自洽的動态變化的物理意義。研究團隊結合經過數年自主開發的新型深度學習高精度三維分類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S複合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀态的高分辨率（3.0~3.6 Å）非平衡構象，通過時間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動力學工作周期，并結合分子生物學功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調控活性的原子結構基礎和非平衡動力學機制。

研究發現USP14的活化同時依賴于泛素識别和蛋白酶體RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過别構效應，誘導蛋白酶體同時沿着兩條并行狀态轉變路徑發生構象變化；研究團隊成功捕獲到了底物降解中間狀态向底物抑制中間狀态的瞬時轉化。在底物降解途徑中，USP14活化變構地重編程AAA-ATP酶馬達的構象景觀（Conformational landscape）和統計分布，并刺激20S底物通道的打開，從而觀察到底物持續轉運過程的ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和近乎完整的全周循環周期。USP14-ATPase的動态相互作用，使得ATPase馬達底物識别與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發生去耦合效應，并在26S的泛素識别、底物的起始易位和泛素鍊回收過程中引入三個調控檢查點（動力學分岔點）。這些發現為USP14調節26S的完整功能周期提供了全新的高分辨見解，并為USP14靶向藥物治療發現奠定了極為重要的機制基礎。

圖2 通過時間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型（Youdong Mao, CC BY 4.0）

2022年4月27日，相關研究成果以“時間分辨冷凍電鏡解析人源蛋白酶體在USP14調控下的變構”（USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM）為題，在線發表于國際頂級學術期刊《自然》（Nature）。beat365“博雅”博士後張書文和beat365官方网站2019級博士研究生鄒士濤為共同第一作者，毛有東為通訊作者。研究工作中的全部冷凍電鏡數據在beat365電子顯微鏡實驗室和冷凍電鏡平台上完成采集，大部分數據分析工作在beat365高性能計算平台上完成。

上述研究工作得到北京市自然科學基金、國家自然科學基金、國家傑出青年科學基金，北大-清華生命科學聯合中心等支持。

論文原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-04671-8

《自然》 研究簡報專欄官方點評：https://www.nature.com/articles/d41586-022-01144-w