毛有東課題組在《自然》發表蛋白質機器動力學研究的重大突破

2018年11月12日，beat365官方网站人工微結構和介觀物理國家重點實驗室、前沿交叉學院定量生物學中心毛有東課題組在《自然》（Nature）雜志在線發表了題為“Cryo-EM structures and dynamics of substrate-engaged human 26S proteasome（底物結合的人源26S蛋白酶體的冷凍電鏡結構和動力學）”的長論文（Article），通過冷凍電子顯微鏡和機器學習技術的結合，解析了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間态構象的高分辨（2.8~3.6埃）精細原子結構，最好局部分辨率達2.5埃。這些三維結構展現了驚人的的時空連續性（Spatiotemporal continuity），生動呈現了原子水平的蛋白酶體和底物相互作用的動态過程，首次實現了對AAA-ATPase激酶六聚馬達分子内ATP水解全周循環的完整過程的原子水平觀測和三維建模，發現三種不同的ATP水解協同反應模式，用于調控蛋白酶體的複雜多樣的功能。論文解決了一系列長期懸而未決的重要科學問題，包括：（1）蛋白酶體如何進行泛素識别和去泛素化；（2）底物是如何與ATPase馬達結合起來的；（3）底物轉運是如何啟動的；（4）ATPase馬達如何将化學能轉化為機械能，進而實現底物解折疊的協同動力學機制。這是Nature上發表的系統性地、優于3.6埃分辨率水平實驗研究超大複合蛋白質機器的動力學過程和原理的第一篇論文，标志着冷凍電鏡的發展終于開始進入期待已久的全原子動力學分析的新時代，被審稿人譽為相關領域的“裡程碑”。Nature編輯部和審稿人對該論文發表極其重視，從9月11日投稿、審稿到11月12日正式Online，僅用掉2個月時間。(Nature論文在線鍊接：https://www.nature.com/articles/s41586-018-0736-4)。

泛素-蛋白酶體體系（Ubiquitin-Proteasome System，簡稱UPS）是細胞内最重要的蛋白質降解通路，對維持生物體内蛋白質的濃度平衡，以及對調控蛋白、錯誤折疊或受到損傷的蛋白的快速降解起着至關重要的作用，參與了細胞周期、基因表達調控等多種細胞進程，由UPS失常引發的蛋白質新陳代謝異常與衆多人類重大疾病直接相關。2004年，Aaron Ciechanover, Irwin Rose和Avram Hershko三位科學家被授予了諾貝爾化學獎，以表彰他們對該降解通路的發現。UPS中蛋白酶體是細胞中最基本的、最重要的不可或缺的、最為複雜的大型全酶超分子複合機器之一，人源蛋白酶體全酶包含至少33種不同的亞基，總原子質量約為2.5MDa。美國FDA批準的多種治療癌症的藥物分子即以蛋白酶體為直接靶标。近年來，随着冷凍電鏡技術的發展和應用，人們對這一大分子機器的結構和功能研究得以不斷深入。2016年，毛有東課題組與合作者報道了人源蛋白酶體基态的3.6Å冷凍電鏡結構及其他三個亞納米分辨構象，并首次發現一個亞穩态構象的核心顆粒（Core Particle，簡稱CP）底物轉運通道處于開放狀态（見PNAS 2016, 113: 12991-12996）。2018年4月，該課題組又報道了6個ATPγS結合狀态下的26S動态結構，包括三個CP開放态對應的亞穩簡并态近原子分辨（4~5Å）結構（見Nature Communications 2018, 9: 1360）。盡管這些工作揭示了蛋白酶體的基本架構和内在運動行為，但由于缺乏蛋白酶體與底物之間的相互作用，人們對于蛋白酶體如何實現底物降解的原子水平工作機制仍一無所知。此外，盡管冷凍電鏡技術近年來廣泛應用于分析具有動态特征的蛋白複合體結構和平衡态構象，但對其中間态結構和非平衡構象分析的分辨率水平往往局限在4～6埃或更低，離真正的全原子水平動力學分析還有相當一段距離。

為了真正實現原子水平的蛋白酶體底物降解動态過程的冷凍電鏡三維重建和動力學表征，毛有東課題組攻克了兩大技術難題。其一，如何在蛋白酶體完成底物降解之前抓到它的所有可能的中間态構象？課題組發展了一種新穎的核酸置換法，利用ATPγS降低AAA-ATPase激酶水解活性的特點，在底物降解中間過程，通過将ATP快速置換成ATPγS，結合快速冷凍的優勢，從而撲捉到蛋白酶體在底物降解過程的中間态。其二，如何在從冷凍電鏡數據中分析出更多構象的同時，還把分辨率做到3埃甚至更好？課題組通過多年持續努力，發展了多種基于人工智能和機器學習的冷凍電鏡圖像聚類的新型算法，并針對蛋白酶體的動力學特征，設計了一套極其有效的整合了多種算法的多構象分類流程。通過這兩套技術方案的完美結合，課題組成功解析了人源蛋白酶體在降解底物過程中的七種不同的、但差别甚微的、高分辨原子水平的天然态構象（Native states），完整展示了蛋白酶體從泛素結合到去泛素化，再到底物轉運的動态過程。與同期在Science上發表的與底物結合的酵母蛋白酶體的4.2-4.7埃冷凍電鏡結構（Science doi: 10.1126/science.aav0725，來自加州伯克利分校和Scripps研究所）相比，該Nature論文不僅總構象數量多一倍，全部構象分辨率還高1-2埃。由于Science論文采用了抑制Rpn11去泛素活性的策略，其非天然态結構中底物并不能真正自由轉運，所推測的機理僅限于底物轉運這一步，對于其他三大Nature論文所回答重要問題均無法給出答案。這體現了該Nature論文不僅在實驗方法的原創性上和數據分析水平和質量上，更在科學發現和問題探究的深度和廣度上大幅超越了來自Science的競争性論文。

作為整個蛋白酶體的動力來源與運轉核心，AAA-ATPase激酶分子馬達展現出了三種不同的核苷酸水解協作模式，6個ATPase亞基協調工作，交替與底物發生相互作用。在去泛素化過程（EB态）中，處于對立位置的兩個ATPase亞基Rpt2與Rpt4水解ATP，而Rpt5與Rpt6則釋放ADP，ATPase内的底物轉運通道被打開，使得底物可以進入軸心通道；與此同時，去泛素化酶Rpn11亞基與泛素及底物發生相互作用，執行其作為去泛素化酶的功能；在轉運起始過程（EC态）中，相鄰的兩個ATPase亞基Rpt1與Rpt5會同時水解ATP，調控顆粒（Regulatory Particle，簡稱RP）發生大規模轉動并釋放泛素；在底物去折疊與轉運過程（ED态）中，三個相鄰的ATPase亞基會分别同步進行ATP的結合、ADP的釋放與ATP的水解，這一過程會單向傳遞下去，将ATP水解釋放的化學能轉換為機械能，使得相應的ATPase亞基發生剛體轉動，推動底物的去折疊和單向輸運，同時CP的轉運通道入口打開，底物被送入通道中進行降解。這些研究結果為幾十年來對蛋白酶體功能的研究提供了寶貴的第一手原子結構和動力學信息，對于理解生物體内蛋白質的降解過程和一系列負責物質輸運的ATPase馬達分子的一般工作原理具有極為重要的科學意義。

課題組博士後董原辰與博士生張書文為本論文的共同第一作者，毛有東為通訊作者。該論文的全部冷凍電鏡數據在北大冷凍電鏡平台上完成采集，大部分數據分析工作在北大高性能計算平台上完成。該論文的發表标準着北大冷凍電鏡平台的建設後來居上，在數據采集效率和成像分辨率等各方面，已達到國際領先水平，具備了相當的國際競争力。該研究項目得到了國家自然科學基金委、北大-清華生命科學聯合中心、美國Intel公司并行計算研究基金、美國國家健康研究院、Edward Mallinckrodt基金會的資助。